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    葡萄无病毒母本树和苗木 Virus-free mother plant and nursery stock of grapevine

    时间:2013-09-03 11:23:28  来源:  作者:

    标准类别  NY/T 农业行业推荐标准
    标准名称  葡萄无病毒母本树和苗木 Virus-free mother plant and nursery stock of grapevine

    标准分类  种植业->水果、蔬菜及制品
    标准号  NY/T 1843—2010

    颁布部门  中华人民共和国农业部

    颁布日期  2010-05-20

    实施日期  2010-09-01

    关键字  葡萄、无病毒、母本树亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、苗木
    标准内容  
    1  范围

    本标准规定了葡萄无病毒母本树和苗木的质量要求、检验规则、检测方法亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、包装和标识亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    本标准适用于葡萄无病毒母本树和苗木的繁育及销售亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    2  规范性引用文件

    下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。

     NY 469  葡萄苗木

    全国农业植物检疫性有害生物名单(农业部公告第617号,2006年3月)

    3  术语和定义

    下列术语和定义适用于本标准。

    3.1  葡萄无病毒原种  virus-free primary source of grapevine

    通过脱毒处理或无性系筛选获得、经单株检测无病毒后隔离保存的原株。

    3.2  葡萄无病毒母本树  virus-free.mother plant of grapevine

    葡萄无病毒原种材料繁育的、用于提供品种或砧木繁殖材料的无病毒母株。

    3.3  葡萄无病毒砧木  virus-free rootstock of grapevine

    从无病毒砧木母本树上取得繁殖材料、经扦插或通过组培获得用于嫁接的葡萄砧木苗。

    3.4  葡萄无病毒接穗  virus-free scion of grapevine

    从无病毒母本树上获得的、用于嫁接繁殖的当年生新梢或一年生成熟枝条。

    3.5  葡萄无病毒苗木  virus-free nursery stock of grapevine

    用无病毒接穗和无病毒砧木繁育的葡萄嫁接苗亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,以及通过扦插、组织培养等方法繁育的葡萄自根苗。

    4  要求

    4.1  葡萄无病毒母本树和苗木无葡萄扇叶病毒(Grapevine fanlcaf virus,GFIV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus 1亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,GLRaV-1)亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、葡萄卷叶病毒3(Grapevine leafroll associated virus3,GLRaV-3)亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)和葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFkV)。

    4.2  无《全国农业植物检疫性有害生物名单》(农业部公告第617号,2006年3月)规定的检疫性有害生物。

    4.3  品种纯正、生长健壮。

    4.4  葡萄无病毒自根苗和嫁接苗的质量符合NY 469的规定。

    5  试验方法

    5.1  葡萄无病毒原种

    5.1.1  葡萄无病毒原种栽培容器中保存于防虫网室或防虫温室中,每个品种5株。每株原种均有编号、来源和病毒检测记录。

    5.1.2  每年生长季节观察树体状况,发现有病毒病症状的植株,立即淘汰并销毁。

    5.1.3  每5年全部复检一次,带病毒植株立即淘汰并销毁亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    5.1.4  病毒检测采用指示植物结合酶联免疫吸附(ELISA)或反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法进行。

    5.2  葡萄无病毒母本树

    5.2.1  葡萄无病毒母本树栽植于没有传毒线虫亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、6年之内未栽植过葡萄的地块,与普通葡萄园和苗圃的距离大于60m亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,修剪工具、生产工具及农机具专管专用,并定期消毒亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    5.2.2  每个生长季节观察树体状况,并抽取5%~10%的母本树进行病毒检测亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。发现有病毒病症状的植株和检测带病毒的植株,立即淘汰并销毁。

    5.2.3  病毒检测采用ELISA或RT-PCR方法进行。

    5.3  葡萄无病毒苗木

    5.3.1  葡萄无病毒苗木应在距离普通葡萄园或苗圃30m以上亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、没有传毒线虫且在3年内未栽植过葡萄的地块进行繁殖,修剪工具、生产工具及农机具专管专用,并定期消毒。

    5.3.2  采用随机取样方法抽取苗木进行病毒检测。以1万株抽检10株为基数(不足1万株以1万株计),10万株内(含10万株)每增加1万增检5株;超过10万株,每增加1万增检2株。

    5.3.3  病毒检测采用ELISA或RT-PCR方法进行亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    5.3.4  等级规格检验按NY 469规定执行。

    6  检验规则

    6.1  指示植物检测

    6.1.1  葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用指示植物进行检测。

    6.1.2  用绿枝嫁接亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、硬枝嫁接或芽接方法,将待检样品嫁接到指示植物上,每个样品重复3株亚博体育网站官网_亚博体育官网入口亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    6.1.3  生长季节定期观察指示植物的症状表现,检测用指示植物和症状表现参见附录A亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    6.2  ELISA检测

    6.2.1  葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒1、葡萄卷叶病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒可采用ELISA方法进行检测。

    6.2.2  取样部位和时间参见附录B。

    6.2.3  ELISA检测具体操作方法参见试剂盒使用说明。

    6.3  RT-PCR检测

    6.3.1  葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用RT-PCR方法进行检测。

    6.3.2  取样部位和时间参见附录B亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    6.3.3  检测程序参见附录C。

    7  标识和包装

    7.1  标识

    7.1.1  葡萄无病毒母本树标签内容包括品种名称、砧木类型、母本树编号、病毒检测单位和检测时间、母本树培育单位。每捆挂2个标签。

    7.1.2  葡萄无病毒苗木标签内容包括品种亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、砧木、等级亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、株数、生产单位和地址。每捆挂2个标签。

    7.2  包装

    分品种、种类(母本树、自根苗、嫁接苗)和等级,分别定量包装,每捆20~30株为宜。注意苗木保湿。包装内外附有苗木标签,不应与普通苗木混装。

    采用二氧化硅吸附法:(1)刮取100mg枝条韧皮部组织放入塑料袋中,加入1mL研磨缓冲液(4.0mol/峨氰酸胍,0.2mol/L醋酸钠,25mmol/L EDTA,1.0mol/L醋酸钾,2.5%PVP-40,2%偏重亚硫酸钠)磨碎;(2)取500μL匀浆置于1.5mL消毒离心管中(先加入150μL 10%N-lauroylsar-cosine)亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,70℃保温10min、冰中放置5min后,14000r/min离心10min亚博体育网站官网_亚博体育官网入口;(3)取300μL上清液,加入150μL 100%乙醇、300μL 6mol/L碘化钠、30μL 10%硅悬浮液(pH2.0),室温下振荡20min;(4)6000r/min离心1min,弃去上清,加入500μL清洗缓冲液(10.0mmol/L Tris-HCl亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,pH7.5亚博体育网站官网_亚博体育官网入口;0.5mmol/LEDTA;50.0mmol/L NaCl;50%乙醇)重悬浮沉淀亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,6000r/min离心1min;(5)重复步骤(4);(6)将离心管反扣在纸巾上亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,室温下自然干燥后亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,重新悬浮于无RNase和DNase的水中,70℃保温4min亚博体育网站官网_亚博体育官网入口;(7)13000r/min离心3min亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,取上清液,保存于-70℃超低温冰箱中。

    C.2  合成cDNA

    5μL总RNA与1μL 0.1μg/μL随机引物5’d(NNN NNN)3’和9μL水混合,95℃变性5min后立即置于冰中冷却2min。再加入含5μL 5×MLV-RT缓冲液、1.25μL 10mmol/L dNTPs亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、0.5μL200 U/μL M-MLV反转录酶和3.25μL灭菌纯水的反转录混合液,经37℃10min、42℃50min亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、70℃5min合成cDNA亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    C.3  PCR扩增

    PCR反应混合液共25μL亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,包括2.5μL cDNA、2.5μL 10×PCR缓冲液、0.5μL 10 mmol/L dNTPs、0.5μL 10μmol/L互补引物亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、0.375μL 2U/μL Taq DNA聚合酶亚博体育网站官网_亚博体育官网入口、18.125μL灭菌纯水。PCR反应条件根据各组引物的退火温度及扩增产物大小设计亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

    C.4  结果判定

    检测时设阴、阳对照,采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,观察到与阳性对照相同的目的条带的样品为阳性亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,带病毒;与阴性对照一样亚博体育网站官网_亚博体育官网入口,未观察到目的条带的样品为阴性,无病毒亚博体育网站官网_亚博体育官网入口。

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